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    真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作步驟

    發(fā)布時(shí)間: 2021-11-29  點(diǎn)擊次數(shù): 1147次

    一些真核蛋白在原核宿主細(xì)胞中的表達(dá)不但行之有效而且成本低廉,然而許多在細(xì)菌中合成的真核蛋白或因折疊方式不正確,或因折疊效率低下,結(jié)果使得蛋白活性低或無(wú)活性。不僅如此,真核生物蛋白的活性往往需要翻譯后加工,例如二硫鍵的精確形成、糖基化、磷酸化、寡聚體的形成或者由特異性蛋白酶進(jìn)行的裂解等等,而這些加工原核細(xì)胞則無(wú)能為力。需要表達(dá)具有生物學(xué)功能的膜蛋白或分泌性蛋白,例如位于細(xì)胞膜表面的受體或細(xì)胞外的激素和酶,則更需要使用真核轉(zhuǎn)染技術(shù)。由于DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞有關(guān)技術(shù)方法的發(fā)展,使真核表達(dá)成為可能。

    利用克隆化的真核基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì),具有以下多種不同用途:

    (1) 通過(guò)對(duì)所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)或生物活性測(cè)定,確證所克隆的基因。

    (2) 對(duì)所編碼的蛋白質(zhì)須進(jìn)行糖基化或蛋白酶水解等翻譯后加工的基因進(jìn)行表達(dá)。

    (3) 大量生產(chǎn)從自然界中一般只能小量提取到的某些生物活性蛋白。

    (4) 研究在各種不同類型細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)的生物合成以及在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的情況。

    (5) 通過(guò)分析正常蛋白質(zhì)及其突變體的特性,闡明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。

    (6) 使帶有內(nèi)含子而不能在原核生物如酵母中正確轉(zhuǎn)錄為 mRNA的基因組序列得到表達(dá)。

    (7) 揭示某些與基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)的DNA序列元件。

    DNA轉(zhuǎn)染技術(shù)現(xiàn)已變成研究基因功能和組分的重要工具,已發(fā)展了很多轉(zhuǎn)染方法,并成功應(yīng)用于轉(zhuǎn)染各種細(xì)胞。目前廣泛應(yīng)用方法有磷酸鈣共沉淀法、電穿孔法、病毒載體,以及陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法。

    進(jìn)行真核轉(zhuǎn)染的一般程序:

    克隆目的基因(經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證)-準(zhǔn)備真核表達(dá)載體-將目的基因插入表達(dá)載體中-轉(zhuǎn)染-篩選-鑒定

    下面以pcDNA3為載體,p16為目的基因,介紹真核轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)操作。

    一、試劑準(zhǔn)備

    1、HBS(Hepes-buffered saline):876mg NaCl溶于90ml ddH2O,加入1M Hepes,調(diào)pH到7.4,補(bǔ)ddH2O至100ml, pH7.4,濾過(guò)除菌。

    2、核酸貯存液,過(guò)濾除菌。

    3、培養(yǎng)基:含血清或不含血清的,用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的正常培養(yǎng)。

    二、操作步驟

    (一)克隆目的基因

    1、根據(jù)GenBank檢索的目的基因序列,設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物,并在上、下游引物的5’-端分別引入酶切位點(diǎn)BamHⅠ和XhoⅠ,行RT-PCR。

    2、回收特異性擴(kuò)增片段,連入T載體。

    3、轉(zhuǎn)化DH5α,質(zhì)粒制備。

    4、酶切初步鑒定,測(cè)序證實(shí)。

    (二) 真核重組表達(dá)載體的構(gòu)建:

    pcDNA3載體帶有在大腸桿菌中復(fù)制的原核序列、便于挑選帶重組質(zhì)粒細(xì)菌的抗生素抗性基因,以及表達(dá)外源DNA序列所必需的所有真核表達(dá)組件。

    重組質(zhì)粒與pcDNA3分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切

    回收插入片段和pcDNA3線性片段

    T4連接酶連接

    轉(zhuǎn)化DH5α

    質(zhì)粒制備

    BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定。

    (三)重組pcDNA3轉(zhuǎn)染SHG-44細(xì)胞:

    1、 G418篩選濃度測(cè)定:SHG-44培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板→G418 分別用100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L加入,各濃度3復(fù)孔,設(shè)正常對(duì)照3復(fù)孔。以10-14天細(xì)胞全部死亡的濃度為篩選濃度,結(jié)果為200mg/L。

    2、 在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前天接種細(xì)胞,各種細(xì)胞的平板密度依據(jù)各種細(xì)胞的生長(zhǎng)率和細(xì)胞形狀而定。進(jìn)行轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞應(yīng)達(dá)到60%-80%覆蓋。一般要求,6孔培養(yǎng)皿(35mm),每孔1-2ml培養(yǎng)基3×105細(xì)胞。依據(jù)不同大小培養(yǎng)板調(diào)整每平方厘米的細(xì)胞數(shù)量。

    典型貼壁細(xì)胞平板密度

    培養(yǎng)板大小生長(zhǎng)面積(cm2大約細(xì)胞數(shù)培養(yǎng)基容積(ml)
    組織培養(yǎng)皿(φ60mm)

    28

    6.6×1055-6
    6孔培養(yǎng)板(φ35mm)

    9.5

    3×1051-2
    12孔培養(yǎng)板φ22.6mm)

    4

    1.3×1050.5-1
    24孔培養(yǎng)板(φ8mm)

    0.5

    0.6×1050.25-0.5

    3、 SHG-44細(xì)胞的轉(zhuǎn)染:

    (1) 轉(zhuǎn)染當(dāng)天,加入脂質(zhì)體/ DNA混合物之前的短時(shí)間內(nèi),更換1ml新鮮的有血清或無(wú)血清培養(yǎng)基。

    (2) 準(zhǔn)備不同比例的DOSPER/ DNA混合物,以確定每個(gè)細(xì)胞系的最佳比例。① 溶液A:用HBS稀釋DNA(pcDNA3、重組pcDNA3)各1.5μg 到總體積50μl(30μg/ml)。②溶液B:用HBS稀釋6μl脂質(zhì)體到終容積50μl(120μg/ml)。③混合溶液A和B,輕柔混合(不要振蕩),室溫孵育15min,以便脂質(zhì)體/DNA混合物形成。

    (3) 不要移去培養(yǎng)基,逐滴加入100μl 脂質(zhì)體/DNA混合物(從培養(yǎng)孔一邊到另一邊),邊加邊輕搖培養(yǎng)板。

    (4) 37℃孵育6hr。

    (5) 6hr后更換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基,加入2-3ml新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

    (6) 轉(zhuǎn)染24hr后施加篩選壓力,改用含G418的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

    4、 G418篩選:在G418篩選濃度下持續(xù)培養(yǎng)14天后,挑出單克隆,擴(kuò)大培養(yǎng),同時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3即SHG-44-vect,并設(shè)對(duì)照組細(xì)胞即SHG-44。

    (一)篩選結(jié)果鑒定:

    (1)基因組DNA提取→PCR鑒定外源基因

    (2)SHG-44-重組pcDNA3陽(yáng)性細(xì)胞、SHG-44-vect裂解→聚丙烯酰胺凝膠電泳→免疫印跡鑒定P16蛋白表達(dá)(Western-blot)。

    (3)測(cè)定外源性基因?qū)HG-44細(xì)胞增殖的影響

    ①流式細(xì)胞儀分析:SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA3→單細(xì)胞懸液→70%酒精固定→裂解細(xì)胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上機(jī)分析G1期和G2/M、S期比例。

    ②細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定:SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA3→5×104/孔接種24孔培養(yǎng)板→24hr后各自用苔盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞→計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制百分率。

    ③軟瓊脂克隆形成率分析:SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA3→104 細(xì)胞→0.3%低熔點(diǎn)瓊脂糖培養(yǎng)→1-2周后計(jì)數(shù)不可少于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)→計(jì)算克隆形成率抑制率。

    三、注意事項(xiàng)

    1、優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件(脂質(zhì)體的用量、DNA密度、細(xì)胞密度、脂質(zhì)體和DNA混合孵育時(shí)間)每種細(xì)胞和質(zhì)粒均須進(jìn)行。用于轉(zhuǎn)染的核酸應(yīng)高度純化。為避免微生物污染,所用溶液濾過(guò)滅菌,以及隨后的使用應(yīng)在無(wú)菌條件下,這是細(xì)胞慣常的做法。但是,脂質(zhì)體以及脂質(zhì)體/ DNA混合物無(wú)需濾過(guò)除菌。

    2、預(yù)備脂質(zhì)體/DNA混合物必須在無(wú)血清下進(jìn)行。但是在隨后的脂質(zhì)體/ DNA與被轉(zhuǎn)染細(xì)胞共孵育的過(guò)程中,血清又是培養(yǎng)基的一部分。

    3、在轉(zhuǎn)染之前更換培養(yǎng)基,可提高轉(zhuǎn)染效率,但所用培養(yǎng)基必須37℃預(yù)溫。

    脂質(zhì)體/ DNA混合物應(yīng)當(dāng)逐滴加入,盡可能保持一致,從培養(yǎng)皿一邊到另一邊,邊加入邊輕搖培養(yǎng)皿,以確保均勻分布和避免局部高濃度。


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