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    大鼠乳鼠成骨細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)——酶消化法

    發(fā)布時(shí)間: 2021-12-05  點(diǎn)擊次數(shù): 1330次

    材料與儀器

    SD大鼠
    F12 *培養(yǎng)液 胰蛋白酶 Ⅱ型膠原酶 酒精
    手術(shù)器械 磁力攪拌器

    步驟

    一、實(shí)驗(yàn)步驟


    1.  拉頸處死24 小時(shí)內(nèi)新生的SD大鼠,75%乙醇浸泡5 min,取出頭蓋骨,分離頂骨和額骨,冰生理鹽水液反復(fù)洗滌大鼠乳鼠顱蓋骨標(biāo)本除去脂肪組織及殘留血,放入另一盛有F12 *培基液的培養(yǎng)皿中再洗滌, 將顱骨剪成2~5 mm2 碎片,將洗滌過的骨碎片用 0.25%胰蛋白酶2 ml 預(yù)消化15 min,以清除纖維組織細(xì)胞,棄去上清液(其中主要含成纖維細(xì)胞)。

    2.  然后以0.1%  Ⅱ型膠原酶10 ml,在37℃環(huán)境中消化 20 分鐘,室溫下磁力攪拌消化20 分鐘。靜置數(shù)分鐘,收集消化液,室溫下以1200 rpm離心10 分鐘。去除上清液,用20% 胎牛血清的F12 培養(yǎng)液4 ml 懸 浮細(xì)胞,接種于75 ml 培養(yǎng)瓶中,補(bǔ)培養(yǎng)液8 ml 使每瓶液體量達(dá)到12 ml;對(duì)靜置后沉淀部分可再重復(fù)以膠原酶消化20 分鐘、磁力攪拌消化15 分鐘、離心10 分鐘,將獲得的3 瓶細(xì)胞放置于二氧化碳培養(yǎng)箱,在5% CO2,95%空氣,37℃溫度下培養(yǎng),24 小時(shí)后可見細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),胞質(zhì)開始伸展,換新鮮培養(yǎng)液,以后每隔48 小時(shí)換培養(yǎng)液(注:消化視具體情況而定,也可多消化 1 遍)。

    3.  原代培養(yǎng)一般接種后第7 天能長(zhǎng)滿。傳代時(shí),取生長(zhǎng)良好、貼壁松緊適度的成骨細(xì)胞 1 瓶,棄去培養(yǎng) 液,傳代時(shí)先以 PBS 沖洗 2 遍,加 0.25%胰酶1 ml,室溫下消化3~5 分鐘,將胰蛋白酶液棄去,加 F12 培養(yǎng)液充分吹打8-10 分鐘。將已消化的細(xì)胞收集、合并,計(jì)數(shù);用 F12 *培基調(diào)節(jié)至細(xì)胞濃度為合適濃 度。一般取2-5 代成骨細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。代數(shù)太多,細(xì)胞老化或者分化明顯。
     
    二、結(jié)果

    如圖所示,成骨細(xì)胞的形狀和成纖維細(xì)胞非常相似,但是不同的是,比成纖維細(xì)胞更不容易消化,尤 其是傳代次數(shù)多,細(xì)胞老化的時(shí)候,非常難消化,并且不易消化成單個(gè)細(xì)胞。
     
    圖1:成骨細(xì)胞

    圖2:成骨細(xì)胞100倍
     

    圖3:成骨細(xì)胞形成的礦化結(jié)節(jié)
    三、鑒定的方法

    1.  堿性磷酸酶(ALP)活性檢測(cè)

    2.  骨玻璃樣蛋白(BGP)檢測(cè)

    3.  礦化結(jié)節(jié)檢測(cè)


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