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斑點(diǎn)和狹縫雜交
發(fā)布時(shí)間： 2022-03-24 點(diǎn)擊次數(shù)： 1004次材料與儀器
去離子甲酰胺 甲醛（37%) 20XSSC NaOH 預(yù)雜交液
狹槽 點(diǎn)樣器 真空泵 可燙封塑料袋或雜交管 硝酸纖維 K 膜或尼龍膜 Whatman3MJV1 濾紙步驟
一、材料與設(shè)備
1) 狹槽
2) 點(diǎn)樣器
3) 真空泵
4) 可燙封塑料袋或雜交管
5) 硝酸纖維 K 膜或尼龍膜
6)Whatman3MJV1 濾紙
7) 去離子甲酰胺
8) 甲醛（37%)
9)20XSSC
10)0.1mol/LNaOH
11) 預(yù)雜交液：50% 甲酰胺，5XSSC，2XDenhardt, 0.1%SDS，100ug/ml 鮭精 DNA。
二、操作方法
(-）樣品處理
將 l0ulRNA10ug，（RNA 可多至 50ug) 水溶液與下述溶液混合：
甲酰胺 20ul
甲醛（37%) 7ul
20XSSC 2ul
于 60℃ 溫育 15 min 使其變性，冰浴冷卻樣品。
(二）點(diǎn)樣
用 0.lmol/LNaOH 清洗點(diǎn)樣器，再用 DEPC 水充分沖洗。將一張經(jīng) 20XSSC 浸潤(rùn)的 Whatman3 MM 濾紙鋪在點(diǎn)樣器上，上面鋪張經(jīng) 20XSSC 浸潤(rùn) 30 min 的硝酸纖維素膜，加蓋并夾緊，接通真空泵。用 10XSSC 清洗各樣孔。在每一 RNA 樣品中加 2 倍體積的 20XSSC，混合后加樣。于外圍幾個(gè)孔中加染料定位，緩慢抽吸，毎孔用 lml10XSSC 淸洗 2 次。繼續(xù)抽吸 5 min，吸干濾膜。
(三) 固定
取出濾膜，室溫晾干后，夾在 2 張 Whatman3 MM 濾紙中間，80℃ 干烤 2 h 以固定RNA
(四）預(yù)雜交
濾膜烘干后放入可燙封塑料袋 (或雜交管）中，加入 20?30 ml 預(yù)雜交液，密封塑料袋后在 42°C 預(yù)雜交 3 h
(五）探針制備及標(biāo)記
參見前面相關(guān)章節(jié)。
(六）雜交
將已標(biāo)記的探針煮沸變性 l0 min，取出后立即置冰浴 10 min(單鏈探針不需要變性），將變性探針加入預(yù)雜交液中，密封雜交塑料袋后在 42℃ 雜交過(guò)夜。
(七）洗膜
雜交結(jié)束后，分別用下列洗液洗膜：
1)2XSSC，0.5%SDS，室溫洗膜 5 min。
2)1XSSC,0.1%SDS，42°C 洗膜 30rnin。
0.1XSSC，0.5%SDS，56℃ 洗膜 30 min。
(八）檢測(cè)
用 X 射線片進(jìn)行放射性自顯影，附加增感屏，一 70°C 曝光 7?10 天。注意事項(xiàng)
1) 使用快速制備法獲得的細(xì)胞總 RNA 有可能污染基因組 DNA, 因此難以用分光光度計(jì)來(lái)精確測(cè)定 RNA 含量。此外還必須防止上樣矯作物的出現(xiàn)。對(duì)半定最分析來(lái)說(shuō)，每一樣品須做兩次狹縫印跡，一張膜與所要檢測(cè)的 RNA 探針雜交，另一張則與另-種RNA 探針雜交，這種在各個(gè)樣品中的表達(dá)都應(yīng)一樣，或者也可以對(duì)一個(gè)樣品制作-次印跡，但同一張膜必須進(jìn)行兩次重復(fù)雜交。
2)RNA 樣品在點(diǎn)樣時(shí)要稀釋 8 倍，因此樣品的濃度至少為 10mg/mL
3) 狹縫雜交很容易出現(xiàn)假陽(yáng)性性信號(hào)。這可通過(guò)以下手段盡可能的避免：①用 Northern 印跡方法嚴(yán)格鑒定探針的特異性；②在所用測(cè)試中均需要有適當(dāng)?shù)年幮詫?duì)照；③須非常細(xì)心地制備所用探針、溶液、RNA 等以避免污染。以上就是本期的內(nèi)容，更多資訊，歡迎點(diǎn)擊安培生物網(wǎng)站鏈接了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。
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