原代細(xì)胞都無法擴(kuò)增幾輪增殖，這被稱為Hayflick極限，因為每一輪的增殖都會縮短端粒。當(dāng)端粒達(dá)到臨界縮短長度時，DNA損傷被觸發(fā)，導(dǎo)致細(xì)胞衰老，如果你試圖培養(yǎng)一個珍-稀原代細(xì)胞群，當(dāng)心它最終會死亡，可以對細(xì)胞進(jìn)行操縱，以繞過衰老過程并變得不朽，原代細(xì)胞永生化就是有這么神奇的事情。

自發(fā)性永生化細(xì)胞最-好-的例子就是癌細(xì)胞，它們可能經(jīng)歷了抵抗衰老的基因變化，并且開始“長生不老"。其實許多癌細(xì)胞株也沒有這種變化，事實上，喬治·蓋伊（George Gey）這位科學(xué)家創(chuàng)造了第一個永生的、可以說是最著名的細(xì)胞株：HeLa細(xì)胞，他在偶然發(fā)現(xiàn)亨麗埃塔（Henrietta）手術(shù)后的腫瘤內(nèi)有高度化生長子宮癌細(xì)胞，在此之前，他測試了數(shù)百個癌細(xì)胞以獲得永生的方法，但是都失敗了。

許多病毒基因影響細(xì)胞周期，因此可以通過消除增殖控制的生物剎車來克服衰老。其中許多是腫瘤抑制基因，因為它們需要抑制腫瘤的發(fā)生。其中最常見的是猿病毒大T抗原（SV-40）的過度表達(dá)，它抑制細(xì)胞的Rb基因和p53基因，這兩種基因都是細(xì)胞生長周期的關(guān)鍵控制器。SV40永生化的細(xì)胞系著名的例子是HEK293T，也稱為293T細(xì)胞，這是一種廣泛用于表達(dá)病毒顆粒和細(xì)胞分析的細(xì)胞系，因為它們很容易轉(zhuǎn)染。其他病毒基因包括來自人乳頭瘤病毒（HPV）的基因，如E6和E7，它們也以Rb和p53基因為靶點(diǎn)，比如人支氣管上皮細(xì)胞HBE-E6E7等。

最著名的不朽基因是端粒酶（hTERT）。端粒酶是一種核糖核蛋白，能夠延長端粒的DNA序列，從而減緩衰老過程，使細(xì)胞經(jīng)歷無限的細(xì)胞分裂。事實上，端粒酶最近被認(rèn)為是一種逆轉(zhuǎn)衰老的潛在機(jī)制。使用端粒酶逆轉(zhuǎn)衰老的問題在于，端粒酶表達(dá)增加也會誘導(dǎo)腫瘤生長。事實上，許多用于創(chuàng)造永生化細(xì)胞系的基因，如hTERT和SV40，都會誘導(dǎo)腫瘤形成。因此，毫不奇怪的是，hTERT經(jīng)常在人類腫瘤中過度表達(dá)，從而賦予癌癥的一個關(guān)鍵特征：不受限制的增殖。這正是我們在使原代細(xì)胞系永生化時使用它的目的！

在某些類型的細(xì)胞中，僅使用一種永生化方法可能會產(chǎn)生少量永生細(xì)胞。因此，根據(jù)您的細(xì)胞系，將腫瘤抑制因子（如上述細(xì)胞周期抑制劑）的抑制和hTERT的表達(dá)結(jié)合起來以增加更多的細(xì)胞永生化的可能。如果你想使你的細(xì)胞系永生化和轉(zhuǎn)化（即使其像致瘤細(xì)胞一樣），也建議使用這種雙重方法，因為有證據(jù)表明，如果沒有永生化，一些細(xì)胞系就不能進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)化。

如何將永生引入原代細(xì)胞系

以上許多不朽的來源都是基于對原代細(xì)胞的基因操作。這需要將外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞。由于許多原代細(xì)胞難以轉(zhuǎn)染，因此將基因改變引入原代細(xì)胞的最-簡-單和最-有效的方法是通過病毒感染。

最-流-行的方法是通過復(fù)制缺陷慢病毒，因為它們比腺病毒安全，腺病毒具有重新感染細(xì)胞的能力，因此含有活病毒的時間更長。逆轉(zhuǎn)錄病毒也可用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然而，它們只能感染活躍分裂的細(xì)胞，從而減少可能被病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞數(shù)量。

警告：原代細(xì)胞不朽可能不是最-好-的途徑！

通過將基因改變引入細(xì)胞，你可能正在深刻地改變細(xì)胞系的表型。雖然這確實使你的細(xì)胞系在某些方面更有用：它可能使你的細(xì)胞更同質(zhì)，從而可以輕松復(fù)制結(jié)果，你可以創(chuàng)建大量細(xì)胞供將來使用，并且它們可能更容易實驗，但使用原代細(xì)胞系仍然有許多好處，原代細(xì)胞可以保持正常細(xì)胞的新陳代謝，可以維持正常細(xì)胞的生理特征，并且具有實驗的統(tǒng)一性和重復(fù)性，但隨著原代細(xì)胞的永生轉(zhuǎn)染，細(xì)胞群體和細(xì)胞機(jī)制發(fā)生改變，這可能會混淆您的實驗，并導(dǎo)致不確定或錯誤的結(jié)果。此外，關(guān)于永生化細(xì)胞如何準(zhǔn)確地模擬真實組織還有很多爭論。

盡管存在爭議，但SV40不太可能感染人類，盡管SV40的作用機(jī)制：p53和Rb突變可能是人類腫瘤中非常常見的突變。因此，重要的是要確定最佳的基因操作來使用永生你的細(xì)胞類型。

盡管永生化細(xì)胞在實驗研究中的效用非常強(qiáng)大，但在使用中必須接受一些警告。與任何實驗?zāi)Ｐ鸵粯?，永生化?xì)胞只是您預(yù)期細(xì)胞系統(tǒng)的模型。

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