組織消化和分離細(xì)胞

1. 在細(xì)胞操作間內(nèi)，放一個(gè)加熱攪拌臺(tái)，上放一個(gè)裝有 100 ml 滅菌水的容量 600 ml 的燒杯，加熱至 37℃。

2. 準(zhǔn)備胰酶液。用水浴或溫箱使胰酶液溫度保持在 37℃。

3. 做一個(gè)冰臺(tái)：將一只平皿裝滿冰后倒置即可，70% 乙醇擦拭平皿后放進(jìn)操作臺(tái)。取 3 個(gè) 60 mm 的一次性組織培養(yǎng)用平皿，加入 5 ml 鹽水 A，標(biāo)記上 1，2,3 放進(jìn)操作臺(tái)的冰臺(tái)上。

4. 取一只干凈加蓋的燒杯，內(nèi)放一塊 Metofane 飽和的紗布，把 0~1 日齡的 Sprague Dawley 幼鼠放進(jìn)該燒杯中麻醉。20 只 幼鼠大約需要 5 分鐘時(shí)間。用 70% 乙醇擦凈燒杯再放進(jìn)操作間。

5. 一次取出一只幼鼠，一定要再蓋好蓋子，然后將幼鼠躺著放在一塊無菌紗布上，用乙醇擦洗其胸部及腹部。把鼠肩胛骨往后夾，使突出胸腔，在肋骨下沿胸骨方向拉一口，摘出心臟放進(jìn)標(biāo)記著 1 的培養(yǎng)皿中。

6. 繼續(xù)處理余下的幼鼠，一定要保持手套及所用器械潔凈，每次解剖約需 1 分鐘。

7. 上述操作完成后，用兩把 5 號(hào)鉗子剔除心臟上結(jié)締組織和血-塊再轉(zhuǎn)入標(biāo)記為 2 的培養(yǎng)皿中。再洗一遍，轉(zhuǎn)入標(biāo)記為 3 平皿中。

8. 取一只無菌巴斯德吸管輕輕把平皿 3 中的鹽水液 A 吸出，然后加入 2 ml 孵育過的胰酶液。用準(zhǔn)備好的第二把無菌解剖刀把心臟切碎成沙粒大小。

9. 把上述切碎的心臟及胰酶液轉(zhuǎn)入加了攪拌子的錐形瓶中。另外吸取 3 ml 新鮮的胰酶沖洗平皿和剪刀并轉(zhuǎn)入錐形瓶，補(bǔ)加胰酶至終體積 10 ml，加上塞子，放入 37℃ 水浴中。打開攪拌器，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至 60 r/min 左右，消化 15 分鐘。

10. 從水浴中拿出錐形瓶，小心吸去上清，上清中的主要成分是血紅細(xì)胞，加入 10 ml 新的胰酶，37℃ 水浴再作用 15 分鐘。

11. 棄上清。加入 10 ml 新的胰酶，用一支一次性帶刻度的吸管吹打溶液兩次，機(jī)械分散細(xì)胞，再孵育 10 分鐘。

12. 上述消化處理的同時(shí)，往一支 50 ml 的一次性無菌錐形管中加入 10 ml 冷的接種培養(yǎng)基。

培養(yǎng)已分離出的細(xì)胞

13. 消化處理之后，小心移出上清至上述加有接種培養(yǎng)基的錐形管中，這就是第一次收集到的分離出的細(xì)胞。余下的組織塊中加入 10 ml 新胰酶繼續(xù)消化。

14. 消化的同時(shí)，上述含培養(yǎng)基和細(xì)胞上清的錐形管以 1200 r/min 離心 4 分鐘。輕輕吸去上清，加 5 ml 接種培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞團(tuán)。

15. 重復(fù) 11~14 步驟 9 次，或直至只剩余少許組織塊為止。將所用細(xì)胞懸液集中于一支錐形管中。

16. 最后一次沉淀細(xì)胞，加接種培養(yǎng)基至 10 ml，吹打幾次以散開所有細(xì)胞團(tuán)。

17. 將上述 10 ml 懸液轉(zhuǎn)移到 100 mm 規(guī)格的無菌組織培養(yǎng)平皿中，于 5% CO2，高濕度的 37℃ 溫箱中放置 1~1.5 小時(shí)，目的是減少成纖維細(xì)胞的污染。

18. 孵育后，收集所有平皿中的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中包含非貼壁細(xì)胞，每個(gè)平皿用 10 ml 預(yù)溫的接種培養(yǎng)液沖刷后收集。量一量最后收集溶液的體積，用臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)細(xì)胞。一般地，總細(xì)胞數(shù)在 5X107~1X108 間，成活率約 85%。

19. 用接種培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整至 5X105~6X105 細(xì)胞/ml，制成接種液。

20. 每只 35 mm 規(guī)格平皿加 2 ml 上述接種液，60 mm 規(guī)格的平皿加 5 ml 的接種液，孵育 4~6 小時(shí)。

21. 4~6 小時(shí)后，用培養(yǎng)基或鹽水液 A 輕輕洗涮平皿兩次，倒掉，加入交換培養(yǎng)基繼續(xù)孵育過夜。

22. 用培養(yǎng)基或鹽水 A 沖洗平皿兩次，加入新配制的交換培養(yǎng)基，繼續(xù)溫育，兩天換一次液。