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    RNAiMAX轉(zhuǎn)染的主要途徑探討

    發(fā)布時間: 2022-04-11  點擊次數(shù): 2644次
       RNAiMAX轉(zhuǎn)染是指將外源分子RNA導入真核細胞的技術(shù),它是研究基因表達調(diào)控,突變分析等的常規(guī)工具。細胞轉(zhuǎn)染可分瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。瞬時轉(zhuǎn)染是指外源基因進入受體細胞后,存在于游離的載體上,不整合到細胞的染色體上。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是指DNA整合到宿主細胞的染色體中。
      RNAiMAX轉(zhuǎn)染的一般途徑如下:
      一、物理介導
      1.電穿孔法
      電穿孔靠脈沖電流在細胞膜上打孔而將核酸導入細胞內(nèi)。本法需用特殊設置(電穿孔儀),把懸浮狀態(tài)的受體細胞和供體RNA共同放入皿中(或杯中),再施以高壓電脈沖,能夠促進RNA通過細胞膜而進入胞內(nèi),并可整合到細胞的RNA中,使細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。若轉(zhuǎn)移的RNA為帶有選擇標記基因的質(zhì)粒,也可在選擇培養(yǎng)基中進行鑒定。
      2.顯微注射
      本法是借助顯微注射器直接把RNA注射入核內(nèi),使之發(fā)生整合入受體細胞基因組中的技術(shù)。本技術(shù)需要有嚴密無菌的凈化室,以免敞開操作污染,同時要能有自動拉針儀以制備顯微針,一般用手動拉針器拉制時要能使針末端有一個0.6cm長的細部,太長易折斷,針尖開口為2-3μm間,針口小于1μm更佳,針尖開口大于5μm易刺傷細胞。
      3.基因槍
      基因槍依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核酸導入細胞內(nèi)??梢詫⒋蠓肿訉爰毎?。
      二、化學介導
      1.磷酸鈣共沉淀法
      磷酸鈣被認為有利于促進外源RNA與靶細胞表面的結(jié)合。氯化鈣+RNA+磷酸緩沖液按一定的比例混合,形成極小的磷酸鈣-RNA復合物沉淀黏附在細胞膜表面,借助內(nèi)吞作用進入細胞質(zhì)。沉淀顆粒的大小和質(zhì)量對于轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要。
      2.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染
      中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹RNA,借助脂質(zhì)膜將RNA導入細胞膜內(nèi)。帶正電的陽離子脂質(zhì)體則不同,RNA并沒有欲先包埋在脂質(zhì)體中,而是帶負電的RNA自動結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上,形成RNA-陽離子脂質(zhì)體復合物,從而吸附到帶負電的細胞膜表面,經(jīng)過內(nèi)吞被導入細胞。
      3.多種陽離子物質(zhì)介導
      DEAE-葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染,原理可能是通過內(nèi)吞噬作用而使RNA轉(zhuǎn)導進入細胞核,此法只適合暫時轉(zhuǎn)染實驗。不適用與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染時要除去血清。
      三、生物介導
      病毒介導的轉(zhuǎn)染,以病毒作為載體,通過病毒感染的方式將外源RNA導入到細胞中,其中以逆轉(zhuǎn)錄病毒及腺病毒轉(zhuǎn)染體系常用。
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